EFECTO DE LA VARIACIÓN DEL POTENCIAL DE HIDRÓGENO EN EL DESARROLLO EMBRIONARIO DE DANIO RERIO (HAMILTON-BUCHANAN, 1822)

Introducción

A nivel mundial el cultivo y comercialización de peces de ornato va en aumento, aunque la producción de estos en el estado de Veracruz no ha sido estudiada a fondo para conocer el estado actual de la actividad, debido a la falta de información (Ruiz-Rojas, et. al., 2016). El cultivo de peces de ornato constituye una alternativa para generar ingresos económicos; la actividad requiere de poco espacio e inversión en comparación a otras especies y estas se pueden producir tanto en áreas rurales como en zonas urbanas. En Veracruz -entre otras especies producidas-, destaca el Danio rerio mejor conocido como pez cebra (transgénicos en su mayoría), sin embargo, la falta de práctica en el manejo y la falta de información ha limitado la reproducción exitosa de esta especie perdiéndose alrededor del 70 % de la producción de alevines, de acuerdo con las observaciones realizadas en un intento de reproducción de la especie en una granja acuícola rural perteneciente al estado de Veracruz.

La biología del pez cebra es idónea para el estudio de procesos de embriogénesis, el desarrollo embrionario es transparente, crecen rápidamente y esto facilita la observación científica; es un fenómeno complejo y puede alterarse por la exposición a distintos químicos aun cuando esta no sea relevante comparada con el tiempo de vida del ejemplar, y las anormalidades pueden culminar en la muerte del embrión o feto (Téllez, et. al., 2016).

La concentración del ión hidrógeno da el pH, este es importante para determinados procesos químicos que sólo tienen lugar a un determinado pH, como el metabolismo y el mantenimiento del balance iónico, así como favorecer otros procesos del ciclo hídrico como la nitrificación y desnitrificación. El pH está relacionado con el equilibrio ácido-base en la sangre, lo que señala la importancia de mantener este parámetro constante para evitar que se produzcan daños internos en el pez cebra, además de que la exposición a un bajo pH podría evidenciar daños en la piel o branquias (Balbuena-Rivarola, 2011).

Marco teórico

La acuicultura ha experimentado un marcado crecimiento en los últimos años, y se enfrenta a diferentes situaciones: financieras, nutricionales, climáticas y patológicas, entre otras. El objetivo principal es mantener las tasas de crecimiento y supervivencia a partir de condiciones óptimas (Argüello-Guevara, et. al., 2014). El pez cebra es una especie de la familia de los ciprínidos (Cyprinidae); Danio rerio es originario de los ríos de India Oriental y Bangladesh (Asia), y son fértiles todo el año. Actualmente la especie reproducida por excelencia es transgénica y se ha logrado reproducir procreando de la misma forma que los peces no transgénicos, pero con una tasa de sobrevivencia de las crías del 10 al 13 % de acuerdo con Scotto (2012), cifra que a la fecha ha mejorado con dedicación y muchos cuidados durante las primeras horas post-fertilización.

Danio rerio es una especie de importancia económica en la acuicultura ornamental, considerado modelo biológico. Sin embargo, es necesaria la generación de conocimiento que proporcione información científica relacionada con su nutrición, crecimiento y reproducción para incrementar sus posibilidades de éxito en las granjas de producción piscícola. Las condiciones bajo las cuales se mantiene en laboratorios han estado en conflicto con sus preferencias naturales; el rango geográfico natural actual exacto no es claro (Reed & Jennings, 2011), puesto que los ciprínidos tienen la capacidad de adaptarse a aguas levemente ácidas o alcalinas.

Potencial de hidrógeno

Existen procesos químicos en el metabolismo de los peces que solamente pueden tener lugar a un determinado valor de pH. Los ciprínidos tienen la capacidad de adaptarse a aguas levemente ácidas o alcalinas, el pH ideal para la reproducción y mantenimiento de Danio rerio aún no es clara, hay una controversia entre varios autores acerca del pH ideal u óptimo para la reproducción o adaptación de acuerdo con el pH del hábitat natural, Reed & Jennings (2011) mencionan que los diferentes contrastes entre el valor ideal del pH parten de una posible identificación errónea del hábitat, pero a su vez de la gran disponibilidad del pez cebra en diferentes lugares en donde se puede reproducir según el propósito de uso, lo cual ha generado una lista extensa de valores de pH óptimo.

Se sabe que los extremos letales de pH para peces en condiciones de cultivo, está por debajo de 4 y por encima de 11 (Rodríguez & Anzola, s.f.), aunque el pez cebra es un organismo que se pueden adaptar a cambios graduales del medio no están adaptados para aguantar cambios bruscos, y el pH no se debe variar más de 0.5 puntos de manera repentina. Un pH muy ácido provoca alteraciones en el epitelio del pez cebra y una exposición crónica podría evidenciar daños en las branquias produciendo una lesión aguada con disfunción respiratoria y muerte, además de daños en la piel, aletas y córnea (Balbuena-Rivarola, 2011), por otra parte, un pH alcalino podría ocasionar daños a la córnea y cristalino como resulta en el caso de la reproducción de truchas. La importancia de mantener constante el valor del pH recae en el hecho de que la nitrificación se puede llevar a cabo a tiempo evitando altas concentraciones que dañan la fisiología del pez. El pH también es un factor a tomar en cuenta en el proceso de la nitrificación, se sabe que esta es más exitosa a valores alrededor de 7 (Sedano & Agustín-Anguís, 2016), por lo que muchos criadores mantienen el pH de sus estanques sobre este valor.

Justificación

La reproducción de peces de ornato es una actividad que se basa en avances del conocimiento de las especies y la aplicación de nuevas técnicas de mantenimiento. Los peces son organismos acuáticos sensibles a la perturbación ambiental, lo que hace visibles los daños teratogénicos por variaciones repentinas en las condiciones del medio, ya sea temperatura, pH, amonio, nitratos o nitritos, cantidad de oxígeno, densidad de siembra u oxigenación y cuando las condiciones del agua son modificadas, la toxicidad o teratógenia genera alteración en la morfogénesis temprana y algunos problemas van a repercutir durante la etapa de alevín con saco vitelino causando mortalidad en los organismos (Álvarez, 2011).

Planteamiento del problema

Los embriones de Danio rerio son una herramienta accesible y eficiente para investigaciones, ya que el sistema inmunitario no está completamente activo hasta los 28-42 días post-fecundación y los embriones metabolizan pequeñas moléculas disueltas en el medio acuoso donde se encuentran, lo que permite evaluar la toxicidad de compuestos solubles en el mismo (Yebra-Pimentel, 2014). Danio rerio como herramienta para estudios tiene la ventaja de que alrededor de 24 horas después de la fecundación los órganos más importantes están ya formados en la larva y durante el tercer día se produce la eclosión (Santos-Merino, 2011), la transparencia de los embriones permite observar en el microscopio todos los estadios de su desarrollo y los huevos son resistentes a la manipulación.

Objetivo

Determinar el efecto de diferentes valores de pH en el desarrollo embrionario de Danio rerio.

Hipótesis

La exposición a un pH distinto de 7 producirá un aumento en la frecuencia de organismos que presenten un marcado retraso en su desarrollo, así como un aumento en la frecuencia de mortalidad en embriones de Danio rerio.

Materiales y métodos

Los embriones se obtuvieron a partir de la reproducción en laboratorio de peces cebra adultos obtenidos en diferentes acuarios en la ciudad de Xalapa, Veracruz (Figura 1), estos se mantuvieron en peceras de 40 litros con luz led con un ciclo luz-oscuridad 12/12 h, a una temperatura de 26 (±2) °C, con un filtro biológico de esponja, alimentados a saciedad dos veces al día con alimento comercial Hojuela Básica marca LOMAS por la mañana y por la tarde. Para la reproducción los adultos se mantuvieron separados y se pasaron a una red 12 horas antes de la puesta a la pecera para recolectar los huevos que una vez fertilizados fueron desinfectados y separados en recipientes etiquetados para iniciar las observaciones y el registro de las mismas.

Se comparó el efecto de tres valores de pH en el agua (pH 6, 7 y 8) donde se desarrollaron 100 embriones de pez cebra en cada valor a partir de lo que se pudieron cuantificar cambios morfológicos por las alteraciones fenotípicas durante las primeras horas post-fertilización en embriones de Danio rerio. En cada tratamiento se realizaron cinco observaciones a las 9, 24, 48, 72 y 96 horas post-fertilización en las que se retiraron 20 huevos embrionados para ser analizados al microscopio. Para las observaciones se utilizó un microscopio óptico marca Laboteca modelo Binocular WF 10X-18mm a un aumento de 4X. Las variables respuestas analizadas fueron las frecuencias de embriones muertos, embriones con retraso en su desarrollo y embriones con un desarrollo normal.

Para determinar las diferencias del desarrollo embrionario en los tres valores diferentes del pH se realizó la prueba paramétrica ANDEVA de una vía para medidas repetidas (Zar, 2010) con el Software SigmaStat 4.0 Advisory Statistics for Scientists desarrollado por Jandel Scientific Software.

Resultados

Se analizaron 300 embriones para determinar la frecuencia de muertes, desarrollo tardío y desarrollo normal en los diferentes valores de pH a los que fueron expuestas las muestras. La comparación estadística con ANDEVA de una vía de medidas repetitivas evidencia de que no hay diferencias significativas entre los tres valores del potencial de hidrógeno a los que fueron expuestas las muestras.

La muerte de 6 embriones representa el 2 % del total de las muestras, el análisis estadístico (F=0.762, gl=4, p=0.498) no refiere diferencias significativas entre los distintos valores del pH. En pH 6 se encontró sólo un embrión muerto a las 48 horas; en pH 7 se reportaron cuatro muertes (una a las 24 h; otra a las 48 h y dos a las 96 h); mientras que en el pH 8 sólo se reportó una muerte a las 96 horas (Figura 2).

El retraso del desarrollo fue más evidente, comparado con las referencias de Soledad-Solís (2013) y Kimmel, et al. (1995). En pH 6 se reporta una frecuencia de desarrollo tardío de 45 embriones (20 a las 9 h; 12 a las 24 h; 8 a las 48 h y 5 a las 72 h); para el caso de pH 7 la frecuencia de desarrollo tardío fue en 53 embriones (20 a las 9 h; 13 a las 24 h; 15 a las 48 h; 4 a las 72 h y 1 a las 96 h) y para el pH 8 la frecuencia de desarrollo tardío fue 47 (20 a las 9 h; 7 a las 24 h; 19 a las 48 h y 1 a las 72 h) representando en total 145 embriones o un 48 % del total aproximadamente. En el análisis estadístico (F=3.297, gl=4, p=0.090) no se encontraron diferencias significativas (Figura 3).

Por su parte, al analizar las frecuencias de embriones con desarrollo normal encontramos 149 embriones representado aproximadamente un 50 % del total. Para el pH 6 la frecuencia se presentó en 64 embriones (8 a las 24 h; 11 a las 48 h; 15 a las 72 h y 20 a las 96h); en pH 7 la frecuencia se presentó en 33 embriones (6 a las 24 h; 4 a las 48 h; 16 a las 72 h y 17 a las 96 h); para el caso del pH 8 hubo una frecuencia de 52 embriones con desarrollo normal (13 a las 24 h; 1 a las 48 h; 19 a las 72 h y 19 a las 96 h). A partir del análisis estadístico no se encontraron diferencias en la frecuencia de embriones con desarrollo normal (F=3.733, gl= 4, p=0.072) (Figura 4).

Discusión

Los valores del pH entre 6 y 9 no suelen producir impactos en cultivos biológicos, aunque sí tiende a interferir en la reacción con otros compuestos como sucede con la concentración de amonio donde las especies que se desarrollan en agua dulce y más alcalina son más tolerantes a la presencia de este compuesto, no así en aguas ácidas como menciona Souza-Bastos, et al. (2015). La concentración del pH no intervino de forma directa en el desarrollo embrionario normal, considerando que se habla de desarrollo temprano y tardío (Álvarez, 2011). El desarrollo embrionario del pez cebra es asincrónico y a pesar de ser embriones de la misma puesta e incubar simultáneamente a la misma temperatura y sin aglomeración se encontraban diferentes estadios al mismo tiempo. Por otra parte, diferentes autores señalan variedad de valores del pH ideal para el desarrollo embrionario del pez cebra, mismos que se encuentran dentro del rango señalado por Meyer (2004) quien describe la capacidad de adaptación de los peces que abarca un rango de pH de 6.5 – 8.5; el pez cebra es tolerante a un amplio rango de tratamientos experimentales (Kwong, et el., 2014). El rango geográfico natural actual exacto del pez cebra no es claro y las condiciones bajo las cuales se mantiene en laboratorios han estado en conflicto con sus preferencias naturales, por lo que cabe la posibilidad de que los datos hayan sido mal identificados según destaca Reed & Jennings (2011).

Los peces toleran un amplio rango de los valores de pH y se mencionan diversos valores “óptimos” para el desarrollo del pez cebra. También cabe mencionar que los valores letales se encuentran por debajo de cuatro y por arriba de once, de acuerdo con Balbuena-Rivarola (2011) y el efecto agudo o crónico depende del tiempo de exposición, por ejemplo, en la reproducción de trucha un pH alcalino evidencia daños en las branquias de los peces.

De los resultados obtenidos del desarrollo embrionario de 100 huevos de pez cebra fertilizados y expuestos a un pH 6 respectivamente durante las primeras 96 horas post-fertilización, tenemos que no hay una relación directa a la acción del valor de pH a que fue expuesto este grupo, pudimos observar que hubo un desarrollo embrionario normal considerando el desarrollo asincrónico mencionado por Álvarez (2011). El punto neutro del pH es 7,0, la constancia del valor del potencial de hidrógeno favorece un mejor desarrollo de los organismos, ya que las variaciones repentinas ocasionan estrés y pueden inducir a la muerte de los organismos. Además, el valor del potencial de hidrógeno interfiere en la reacción de otros parámetros, en un rango de 7-8 la nitrificación exitosa (Sedano & Agustín-Anguís, 2016).

La relación más directa en cuanto a las preferencias del pez cebra por un medio u otro en este experimento se observaron en aguas más alcalinas; es decir, de las muestras correspondientes a un pH 8 donde se identificó que las muestras cumplieron con un desarrollo normal más cercano a los estadios que describen Soledad-Solís (2013) y Kimmel et. al. (1995) considerando el desarrollo asincrónico (Álvarez, 2011). Estos resultados corroboran la información presentada por Lawrence (2007) quien refiere la preferencia del pez cebra por aguas en calma o con bajo movimiento, que sean transparentes y ligeramente alcalinas (pH ≈ 8.0).

El pH inicia una acción en el embrión desde el momento en que adquiere contacto con el agua; el daño depende del tiempo de exposición y de la concentración del pH y otros factores que se relacionen directamente, como la temperatura y el manejo en general que incluye la salud y madurez de los reproductores antes de la puesta para garantizar embriones sanos, esto es clave para un manejo eficiente y la obtención de buenas puestas. La capacidad del pez cebra para adaptarse o sobrevivir a un medio determinado o cambiante es alta, sin embargo, la obtención de buenas puestas si es posible que mantenga una relación directa con la constancia del potencial de hidrógeno ya que en aguas ácidas la nitrificación no se lleva a cabo a tiempo y esto interfiere en el desarrollo normal de los organismos.

La flexibilidad que posee el pez cebra en el ámbito de adaptación para reproducirse en diversidad de ambientes como el uso exitoso en pruebas de laboratorio, escuelas, acuarios, para experimentos y como hobby da cabida a que se desconozca realmente cual es el hábitat predilecto, ya que una vez que los peces se han adaptado a un ambiente determinado la reproducción no será problema. Danio rerio es un pez capaz de desarrollarse en diferentes valores del potencial de hidrógeno (6, 7 y 8) lo cual confirma la diversidad de datos proporcionados por los autores sobre la preferencia del pez cebra por un valor u otro. También es posible comprobar que los requisitos específicos para alimentar, agrupar y criar a estos animales, además de factores ambientales pueden variar de un criadero a otro. Los resultados obtenidos permiten comprobar lo reportado por Reed & Jennings (2011) al afirmar que se trata de una especie que se adapta o sobrevive en distintos cuerpos de agua de pie o movimiento lento como piscinas, estanques, lagos, zanjas o arrozales con lo cual se corrobora la capacidad de adaptación a aguas tranquilas y poco estables.

Conclusiones

El desarrollo normal y tardío, así como las muertes que se presentaron en las muestras observadas expuestos a diferentes concentraciones del pH no muestran una acción directa de los valores implementados; el resultado de la exposición a pH 7 no es mejor que los resultados de los valores 6 y 8 ya que el retraso del desarrollo embrionario se asocia al desarrollo asincrónico que presenta esta especie y de manera similar el desarrollo embrionario ocurre sin complicaciones que limiten tal ciclo.

Sin embargo, es importante destacar que la constancia de un mismo valor permite un mejor desarrollo de estos organismos, dado que es una manera de mantener un equilibrio del estado de defensas, lo cual evita la presencia de enfermedades y aumenta la capacidad de un mejor desarrollo.

Además, cabe mencionar que se comprueba la facilidad que manifiesta esta especie por desarrollarse en diferentes ambientes, lo cual es una ventaja para implementarlo cada vez más en áreas de investigación y experimentación. Sin embargo, el uso desmedido de la especie y la flexibilidad de esta por sobrevivir muestra lo fácil que resulta la posibilidad de invadir aguas de ríos y pequeños crecientes de agua en donde no se podía ver a estos peces.